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Acelerando A Cura Das Fraturas Imprimir E-mail
Autoria de Dr. Luiz Gonçalves Pinto   
05 de outubro de 2005
    OTENCIAL FUNÇÃO DA TERAPIA GÊNICA NA ACELERAÇÃO DA CURA DA FRATURA

  •     O processo de cura da fratura é biologicamente eficiente, mas em 5 a 10% dos casos é retardada ou não ocorre e isso levou a introdução de novas tecnologias que buscam acelerar estes processos biológicos.

  •     Entre estas tecnologias está o uso de proteínas promotoras de crescimento e da terapia gênica na cura da fratura.

  •     Recentes avanços no entendimento da biologia da osteogênese tem aberto novos caminhos para acelerar a consolidação óssea de maneira clinicamente proveitosa.

  •     Maior atenção tem sido focada nas potentes propriedades osteogênicas de certos fatores de crescimento, particularmente da superfamília do fator que altera o crescimento (TGFb) e vários deles são agora introduzidos em experiências clínicas humanas.

  •     Todavia, a curta meia-vida biológica desses fatores pode impor severas restrições em sua utilidade clínica. Antes que o potencial dos fatores de crescimento possam ser usados como agentes intensificadores da consolidação da fratura, métodos convenientes devem ser desenvolvidos para obter concentrações terapêuticas dos fatores apropriados e mantidos por tempo maior no local da fratura.

  •     Uma abordagem para conseguir estas metas envolve o uso do implante de um artefato biodegradável que atua como uma estratégia de liberação lenta. Os autores sugerem transferência gênica como uma alternativa de acesso.

  •     Liberação gênica não somente pode prover uma melhor via de obtenção de uma elevada e mantida concentração de fatores de crescimento localmente no defeito ósseo, mas também pode levar à uma maior resposta biológica.

  •     Isto pode ocorrer porque a proteína sintetizada endogenamente, diferentemente da proteína recombinante exógena, tolera modificação post translacional adequada.

  •     Além disso, as células de algum modo podem apresentar fatores de crescimento de uma maneira biológicamente favorecida, não imitando os mesmos fatores de crescimento quando eles são fornecidos exógenamente.

  •     Liberação gênica pode ter valor adicional no tratamento de aspectos problemáticos. Pouca atenção tem tido os componentes biológicos dos processos de cura diferentemente dos fatores de crescimento.

  •     Mas há numerosos outros componentes necessários sem os quais os fatores de crescimento se tornariam inefetivos. Os receptores celulares para estes fatores são um exemplo.

  •     Porque estes receptores são tipicamente proteínas transmembrana, sua aplicação exógena não irá provavelmente restabelecer a responsividade biológica.

  •     Em contraste, transferência de genes codificando os receptores devem efetuar este restabelecimento porque as moléculas sintetizadas endógenamente serão inseridas na membrana plasmática de maneira normal.

  •     Outra questão pobremente investigada é se alguns casos de retardo de consolidação ou não consolidação podem envolver produção local excessiva de mediadores de osteoclastos como IL1 e IL6.

  •     Nesses casos, liberação local de genes codificando apropriadas moléculas do antagonista da citocina poderia ser útil. Liberação de um DNA complementar (cDNA), codificando IL1Ra, por exemplo, já está em testes clínicos para o tratamento da artrite reumatóide.

  •     Finalmente, como discutido por Bruder et aI há a questão se o reparo da não união requer células osteoprogenitoras adicionais. Neste caso, isto dará a oportunidade de introduzir genes nestas células antes que elas retornem ao paciente, unindo ex vivo geneterapia e celulaterapia.

    TRANSFERÊNCIA DE GENES

  •     Fatores de crescimento, como outras proteínas, são sintetizadas pelo corpo usando a informação genética presente nos genes que as codificam. Quando um gene codifica um fator de crescimento é isolado e transferido à célula na maneira correta, e a célula recipiente começa a produzir particularmente o fator de crescimento em questão.

  •     As células recipientes em repouso dentro do foco de fratura, irão sintetizar o fator de crescimento na fratura e podem continuar a fazê-lo por um longo tempo. Quando muitas células fazem isso juntas, elas produzem alta concentração local de fator no local da fratura.

  •     Outros tecidos e órgãos não contém o gene transferido e portanto não sintetizarão o fator desta maneira, uma circunstância que minimiza efeitos colaterais. Usando estes princípios, os quais obviamente não são restritos à liberação dos fatores de crescimento, o grupo de pesquisadores está tentando liberar genes no local da fratura para promover a cura.

  •     Evans e Robbins têm dado uma descrição detalhada dos conceitos básicos da geneterapia e sua aplicação em problemas ortopédicos. Um protocolo de geneterapia bem sucedido requer vários componentes incluindo a disponibilidade de genes apropriados, e sistema eficiente para transferi-los às células alvo e a habilidade para obter níveis suficientemente altos de expressão gênica pelo período de tempo que for necessário.

  •     DNA complementar codificando muitos fatores osteogênicos, seus receptores, antagonistas das citocinas, e outras proteínas de interesse tem sido geradas e clonadas, deste modo sua disponibilidade não é limitante para a geneterapia. Em contrapartida, são necessários esforços direcionadas para o desenvolvimento de métodos para transferir estes genes às células no foco de fratura e adquirir um nível apropriado de expressão gênica pelo tempo que for necessário.

    ESTRATÉGIA PARA A TRANSFERÊNCIA DE GENES

  •     Dois principais debates envolvem a transferência de genes às células do corpo. A primeira está na escolha do veículo de liberação gênica, conhecido como vetor.

  •     O outro debate é a questão se os genes poderiam ser introduzidos ao interior das células in situ ou extracorporalmente.

  •     Para iniciar expressão gênica, o DNA exógeno deve penetrar na célula, evitando degradação lisosomal e entrando no núcleo onde se encontra a maquinaria transcricional. Sem a ajuda de um veículo de transferência, é usualmente um processo muito ineficiente.

  •     Todavia, o uso de “NAKED DNA” tem vantagens de custo e segurança e, em alguns casos, resulta em níveis terapêuticos de expressão gênica.

  •     Maior quantidade e expressão de genes pode ser intensificada incorporando-os dentro de vetores, que podem ser não viral ou viral. Vetores não virais, como os liposomas, são mais fáceis de produzir e usualmente menos antigênico do que vetores virais. Eles também promovem menos preocupação de segurança.

  •     Entretanto, expressão gêníca com vetores não virais freqüentemente são transitórias e bem menores do que as obtidas com vírus. Vetores tem sido desenvolvidos de numerosos e variados vírus.

  •     Estes derivados de retrovírus, adenovírus, vírus herpes simples e vírus adenoassociados tem entrado em experiências clínicas humanas.

  •     Vírus tais como retrovírus e vírus adenoassociados que completam seu genoma dentro do DNA cromossomal do hospedeiro, podem prover melhores oportunidades para expressão gêníca de longa duração do que vetores baseados em vírus não integrantes tais como adenovírus e vírus herpes simples.

  •     A propósito, a fratura curando, a expressão gênica transitória pode ter a vantagem de prevenir superprodução de fatores tróficos após ter ocorrido a cura.

  •     A expressão gênica após transferência com adenovírus e vírus herpes simples como vetor é tipicamente alta e transitória, o que pode ser ideal para reparar tecidos como o osso. Estes vetores podem ser usados em associação com estratégias de liberação gênica ex vivo e in vivo.

    ESTRATÉGIAS PARA INTRODUZIR GENES DENTRO DO FOCO DE FRATURA

  •     A transferência de gene pode ser obtida por injeção direta de vetores dentro do local da fratura (liberação in vivo) ou por remoção de células, geneticamente manipuladas fora do corpo e após retomando ao foco da fratura (liberação ex vivo).



  •     Qualquer uma das vias, a transferência gênica é expressada na fratura, induzindo a manter a produção local de produtos gênicos que atuam na osteogênese.

  •     O acesso ex vivo requer a remoção de células do corpo, sua manipulação genética in vitro, e o retorno das células geneticamente alteradas ao local desejado. Para a geneterapia in vivo, o vetor é introduzido diretamente dentro do corpo.

  •     O acesso in vivo é simples, mas o acesso ex vivo em muitos casos tem a vantagem da segurança. Ele também permite o uso de certos vetores que, por várias razões, não podem ser usados para liberação gêníca in vivo.

  •     Para pacientes com múltiplas fraturas pode ser possível liberar sistemicamente células manipuladas, confiando em sua habilidade de alojar-se nos locais do trauma ósseo. Liberação sistêmica desta maneira pode ser preferível a tratar cada fratura individualmente.

    LIBERAÇÃO DO GENE ÀS FRATURAS

  •     Os autores começaram investigando dois métodos de transferência gênica aos locais de fratura. Um é um protocolo ex vivo envolvendo as células do estroma da medula óssea, e o outro é um procedimento in vivo injetando vetores diretamente dentro do local de um grande defeito segmental produzido experimentalmente.

  •     Devido a natureza investigatória desses estudos, o marcador de genes lacz, neo, e luciferase tem sido usados.

    LIBERAÇÃO EX VIVO

  •     Células do estroma da medula óssea oferecem várias vantagens no contexto atual como veículos para uma liberação gêníca ex vivo. Elas são isoladas diretamente da medula óssea, e podem ser transcritas in vitro com vetores retroviral e adenoviral.

  •     Há a possibilidade de injetar estas células Iocalmente dentro do foco da fratura ou liberando-as sistemicamente; em tais casos elas podem ter a propriedade importante de não somente alojar-se no osso mas também talvez acumular-se nos locais da fratura.

  •     Usadas destas maneiras, células do estroma poderiam não somente prover a origem local de fatores de crescimento, mas também ajudar a cura providenciando células osteoprogenitoras.
  •     A possibilidade de liberação ex vivo tem sido descrita recentemente. Balk et al isolaram células de estroma de camundongo e transcreveram-as com retrovirus, sendo um adenovirus carregando o gen lacz e um retrovirus carregando o gen lacz e neo. Infecção viral não irá interferir com a habilidade das células em responderem à proteína morfogenética 2 do osso (BMP2) e, sob condições apropriadas, expressar marcadores de diferenciação osteoblastica in vitro.

  •     A habilidade destas células em formar cartilagem e osso in vivo foi testada por semeadura dentro de cubos cerâmicos e implantando os cubos subcutâneamente em camundongo atímico. O resultado desses experimentos confirmou a habilidade destas células em formar cartilagem e osso in vivo, e expressar o gene marcador lacz em tecidos diferenciados.

  •     Allay et al recentemente relataram achados similares usando células de estroma humano.

  •     Quando células murinas do estroma modificadas geneticamente retornaram ao camundongo singênico por injeção intramedular, elas podiam ser detectadas na medula dos ossos injetados e não injetados do mesmo animal, sugerindo que as células são hábeis em trafegar entre diferentes compartimentos da medula óssea.

  •     Nesta hora, as células aderem na superfície trabecular do osso e parecem estar no processo de diferenciação dentro dos osteoblastos. Durante este período, expressão do marcador gênico transferido permanece alta.

    LIBERAÇÃO IN VIVO

  •     Para testar métodos alternativos de transferência gênica às fraturas, um modelo com defeito segmental anelar foi usado.

  •     O femur de coelhos foram expostos cirúrgicamente e estabilizados com placa de fixação interna. Um defeito de 1,3 cm foi criado.

  •     Após, a ferida foi irrigada com solução salina e um compartimento foi formado fechando firmemente os músculos adjacentes ao redor do defeito.

  •     Transferência local de gene era acompanhada injetando primeira geração de adenovirus carregando o marcador gênico Iacz e luciferase para o interior do local que estava o defeito.

  •     Em uma série de experimentos, uma suspensão viral foi injetada diretamente dentro do espaço.

  •     Em outro, o vírus foi associado com um transportador de colágeno. Tecidos locais e distantes deles foram excisados.

  •     A presença de células lacz foram determinados histoquimicamente, e a presença de luciferase foi dectada por teste enzimático.

  •     A transferência gênica usando colágeno como transportador foi ineficiente, presumivelmente porque o colágeno impede o vírus de alcançar as células.

  •     Contrastando, a injeção direta de uma suspensão adenoviral resultou em eficiente transferência gênica às celulas presentes nos extremos ósseos da lesão, cicatrizando o tecido no espaço e músculos que o envolvem.

    ATIVIDADE DA LUCIFERASE EM DEFEITO SEGMENTAL EM COELHO



    LIBERAÇÃO IN VIVO

  •     A expressão de luciferase em vários tecidos após liberação adenoviral in vivo da luciferase dentro de um defeito segmental.

  •     Os coelhos foram sacrificados em tempos indicados após injeção de adenovirus recombinantes carregando o gene da luciferase dentro de um defeito segmental criado experimentalmente.

  •     Tecidos dentro e ao redor do defeito, pulmão, fígado e baço foram estimulados pela atividade da luciferase.

  •     Não há evidência de transferência gênica ao pulmão ou baço, e somente nível baixo e transitório de expressão no fígado. A expressão gênica nas células presentes nos tecidos musculares e cicatriciais declinam com o tempo e vão perdendo a atividade entre 2 e 6 semanas após a injeção de adenovirus. Com o osso, entretanto, há evidência de expressão gênica com 6 semanas.

  •     Liberman et aI recentemente informaram que usaram um adenovirus para transferir ex vivo a proteína morfogenética 2 ao osso (BMP2) e DNA complementar (cDNA) ao interior das células da medula óssea do rato. Essas células são hábeis em acelerar a cura no modelo com defeito segmental.

  •     Estes dados preliminares confirmam que é possível usar estratégias de transferência gênica ex vivo e in vivo para transferir genes para o osso e, no caso de liberação adenoviral local, para expressá-los no local da fratura. Expressão gênica intraóssea dura por várias semanas após retorno ao camundongo das células do estroma modificadas geneticamente.

  •     Expressão de marcadores gênicos no local da fratura após injeção in vivo de vetores adenoviral persiste no mínimo 2 semanas nos tecidos moles circundantes e talvez igualmente por mais tempo no osso. A duração da expressão necessária para o processo ser clinicamente útil não é conhecido.

  •     Os dados preliminares sugerem que esse prolongamento de expressão gênica deve ser prontamente alcançado, encorajando o desenvolvimento de protocolos adicionais baseados na liberação de genes osteogênicos nos locais da fratura para sua reparação.

  •     Embora encorajador, estes dados são preliminares. Está clara a necessidade de mais pesquisas dentro da biologia básica na cura da fratura, investigando como este processo é prejudicado em humanos como não união e outros defeitos na osteogênese.

  •     Embora existam boas evidências para mostrar que os fatores de crescimento osteogênico são envolvidos no reparo natural, permanece obscuro se estes fatores sozinhos serão produtivos no ambiente anormal de uma não união.

  •     Como mencionado anteriormente, há pouca informação na distribuição de receptores através dos quais estes fatores de crescimento operam, ou na presença de inibidores da osteogênese e mediadores osteoclásticos. Admite-se que fatores angiogênicos também podem ser requeridos, mas poucos dados existem para provar isso.

  •     Uma vez que estas substâncias tem sido pesquisadas, ter-se-á uma idéia mais clara de quais genes precisam ser usados para aumentar a cura da fratura por procedimentos genéticos.

    CONCLUSÃO

  •     A terapia gênica está saindo rapidamente do laboratório para a clínica. Entretanto, vários problemas permanecem para serem resolvidos; um número de ensaios clínicos estão em andamento e as primeiras aplicações da terapia gênica para tratar doenças do sistema músculo-esquelético humano estão começando.

  •     Pacientes com extensas alterações ortopédicas são bons candidatos para terapia gênica e o cirurgião ortopedista terá várias aplicações em seu uso clínico nos próximos anos.


Última Atualização ( 30 de abril de 2008 )
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